在流式数据分析的日常操作里，大家经常会碰到两个问题，一个是怎么梳理FlowJo的门控层级，另一个是调整门控层级后，统计结果对不上该怎么处理；门控层级和普通的文件夹不一样，它直接决定了每一步统计，是从哪一组细胞里接着筛选目标群体。同样是CD4阳性的细胞门，放在活细胞门的下级，和放在CD3阳性细胞门的下级，算出来的比例肯定有差别；前者算的是占活细胞的比例，后者才是占T细胞的比例。在FlowJo当中，子门的细胞都来自对应的父门，双击某个门控就能打开对应的子群体图；也正是因为这样，父子层级关系一旦改动，后面统计出来的事件数、百分比还有表格里的数据，都会跟着发生变化。

　　一、FlowJo门控层级怎么整理

　　想要整理好门控层级，得先把整体的分析顺序确定下来；不要一边画门一边临时改动分析的逻辑，不然最后树状的门控结构看起来条目不少，可不同样本的统计口径不一样，做出来的统计表就会乱掉。

　　1、先固定主门控路径

　　常规的分析流程，可以按照总事件、细胞群、单细胞、活细胞，再到目标细胞群的顺序一步步往下整理；不同的实验不用完全照搬这个顺序，有的实验要先设置时间门，有的要先去掉细胞碎片，还有的得先排除粘连细胞。最关键的不是照搬固定的步骤，而是同一组的所有样本，必须用同一条分析逻辑；要是前面几个基础门的位置都没定稳，后面再细分CD3、CD4、CD8还有各个阳性亚群，得出来的结果也不会稳定。门控树越靠后的层级，对前面每一级父门的准确度依赖就越强。

　　2、门控名称要统一

　　各个门的命名要保持统一，不要随便起名；比如同一个细胞群体，一会儿叫CD4阳性，一会儿叫CD4T细胞，一会儿又叫辅助性T细胞。等后面做统计表格、布局图还有批量导出数据的时候，名称不统一很容易出现漏统计的情况；FlowJo的细胞群面板，可以显示选中组别里的所有细胞群体，还能提示这些群体在组内是不是保持一致，用来检查门控树有没有混乱很合适。

　　3、复制门控时看清落点

　　要把一套门控复制到其他样本上的时候，最好先从已经核对过的代表性样本开始操作；FlowJo支持把门控、统计项或是细胞群节点拖动到目标位置，拖动完成后，它就会变成目标节点的子节点。简单来说，拖到样本的根节点下面，和拖到某个子群体的下面，最终得到的结果是完全不一样的。

　　二、FlowJo门控层级调整后统计结果不一致怎么办

　　调整门控层级之后，要是发现统计结果对不上，先别急着觉得是软件算错了；大多数情况，都是父门设置、统计分母或是样本组同步出了问题。门控只要换了父级节点，对应的统计口径也就跟着变了。

　　1、先看父门有没有变

　　可以先选中结果有异常的细胞群体，顺着门控树往上查看它的父级节点；比如原来的CD8阳性门在CD3阳性门的下级，现在被拖到了活细胞门的下级，那细胞事件数可能变化不大，但百分比会出现很明显的差别。因为计算的分母变了，得到的结果自然不能和原来的直接放在一起比；这类问题在复制门控的时候特别常见，尤其是从一个样本拖动到另一个样本时，如果没有拖到相同的父节点下面，表面看门的名字是一样的，实际的分析路径已经不一样了。

　　2、检查统计量分母

　　还要核对统计量的计算分母，FlowJo的统计项里，常见的父群频率，指的是当前细胞群占上一级父细胞群的比例；祖父群频率，则是占上两级细胞群的比例。如果只看表格里的百分比数字，不区分它是按父群算的、按祖父群算的，还是按总事件算的，就很容易把两个统计口径不一样的结果放在一起比较。写实验报告的时候，建议把关键指标表述清楚，比如写成CD4阳性细胞占CD3阳性细胞的比例，而不是只写CD4阳性比例；少了这几个限定词，读者的理解可能就会出现偏差。

　　3、确认整组样本有没有同步

　　还要确认整组样本有没有同步调整，有时候操作人员只改了一个样本的门控，其他样本还保留着原来的旧层级。FlowJo可以把整套门控和统计项应用到组内的多个文件，操作方法是选中完整的门控层级后，拖动到目标组别里；如果只复制了某一个子门，而不是完整的整条门控树，组内的样本就可能出现一部分用新口径、一部分用旧口径的情况。

　　三、门控层级调整后怎么减少返工

　　FlowJo的门控设置，最好在正式导出统计表之前就整理清楚；等布局图、统计表格和分组比较都做完了，再去改门控的父子关系，后面很多内容都得重新核对一遍，会浪费不少时间。

　　1、先用代表样本试门

　　可以先挑几个阴性对照、阳性样本还有边界样本分别查看，确认门的位置、层级还有统计项都设置合理了，再复制应用到整组样本上；不要刚画完第一个样本的门，就直接套用到所有文件里。

　　2、保留调整前Workspace

　　要大幅修改门控层级之前，先另存一个版本的工作区文件；门控树拖错了虽然可以改回来，但如果已经导出过统计结果，再想追溯原来的统计口径就会很费时间。尤其是论文数据、实验报告、客户项目的相关数据，一定要留存好对应的版本文件。

　　3、重新检查Table和Layout

　　层级调整完成之后，表格编辑器里的统计项也要重新核对一遍；FlowJo的表格统计，可以直接从工作区拖到表格编辑器里，拖入门控的时候，通常会生成对应的父群频率相关列。如果旧的表格还在引用原来的细胞群路径，导出的数值，就可能和当前门控树显示的结果不一致。

　　总结

　　总的来说，梳理FlowJo的门控层级、处理层级调整后的统计差异，核心是把门控树当成分析的统计口径来管理。整理的时候，先固定好主分析路径，再统一命名规则，复制门控的时候看清楚拖动到哪个父节点下面；结果出现不一致的时候，先检查父门设置、统计分母、样本组同步情况还有表格的引用路径。门的名称一样，不代表统计口径就一样，只有父子层级关系和计算分母都保持一致，FlowJo导出的事件数、百分比还有分组比较的结果，才具备可比性。