在同一套流式实验当中，样本数量一旦多起来，就没办法再给每个样本都从头开始画门了，这时候可以利用FlowJo软件里的复制门控、样本分组以及保存Workspace模板这些功能，把分析流程重复地用在不同的样本上。不过得先有个底，门控模板仅仅是把画门的位置、层级关系还有统计的步骤转移过去了，它并不会自动替你去修正每个样本在补偿、数据变换、采集质量以及细胞群漂移方面的差异。按照官方资料的说明，如果加载的新数据本身就带有采集补偿矩阵，那么它就会直接进入模板，并把门控套用上去。

　　一、FlowJo门控模板怎么复用

　　在复用门控之前，先要从已经采集到的样本里挑出一管质量比较稳定、补偿设置正确、而且细胞群分布也足够清楚的代表性样本来，用它作为模板样本。千万别选那种异常样本去画第一版门，要不然后面批量套用的时候，所有结果都会整体跟着偏掉。

　　1、先建立一套标准的门控树

　　打开那个代表性样本之后，照着顺序把各个层级的门一个一个地建起来，比如先设好FSC跟SSC的门，再画出Singlets的门，接着是Live cells、CD45，最后圈出目标细胞群和功能标记等等。门控的名称要写清楚一些，因为后面生成统计表格或者输出布局的时候，还会直接引用到这些名字，图省事乱填的话到时看数据会一头雾水。

　　2、把门控复制给同一组的样本

　　在Workspace里面，把那个已经完成门控的样本点选出来，然后按住它的门控节点，用鼠标拖到对应Group上面，或者也可以复制之后粘贴给同组的其他样本。FlowJo这套软件的分析思路本来就是靠Workspace来管理样本、门控和统计的，样本在分好组以后，同一套分析流程就可以直接套用到组里的每一个样本上面，省得重复劳动。

　　3、存成模板工作区备用

　　如果同一套实验方案以后还需要反复地使用，那就能把当前的Workspace另外保存成一份模板。下次再把新的FCS文件加载进来的时候，要记得检查一下补偿矩阵和参数名称是不是还跟原先保持一致。这样的模板适合用来处理重复性的实验，但如果实验的面板变了、仪器的设置不一样了，或者荧光组合改过了，那就不要再把它们硬套在一起用，不然很容易出乱子。

　　二、批量套用模板后门控为什么会偏

　　门控位置出现偏移，并不全是模板本身画得不对，流式数据是很容易受到补偿矩阵、数据变换方式、仪器当时的电压、细胞本身的状态还有样本处理过程这些因素共同影响的。批量套用之后如果发现了偏差，首先得判断清楚，到底是所有样本一起偏了，还是只有其中的一部分样本发生了漂移。

　　1、补偿矩阵不一致

　　不同批次的实验数据要是用上了不一样的补偿矩阵，那么门控的位置就很可能发生错位。在FlowJo里面，模板如果是基于某套补偿参数建立的，新数据加载进来后会继续沿用当前的矩阵；但要是新数据要求配上新的补偿矩阵，那就必须把门控重新检查一遍。因此，在正式开始批量套门之前，要先确认好补偿矩阵是不是已经给到了正确的样本组，别让矩阵跟样本对应不上。

　　2、变换或者坐标缩放方式有差别

　　FlowJo里的变换设置，会让细胞群体在图上显示的位置发生变化。通常同一个补偿矩阵下的样本会共享相同的变换方式，可一旦换掉了矩阵，坐标轴的缩放比例说不定就会跟着改变。如果发现门的位置整体都发生了偏移，不妨先去查看一下Logicle、Biexponential或者其他的变换设置，然后还要检查一下坐标轴的范围，把这些基础条件校准了再看门。

　　3、样本质量和细胞群漂移带来的影响

　　样本里面死细胞多、碎片多、染色强度往下掉，或者仪器的状态发生了改变，这些都会使得细胞群在图上的位置产生移动。如果还在不管不顾地硬套模板，就很有可能漏掉真实的目标细胞群，或者反过来把非目标的细胞也圈了进来。特别是阳性群体的表达强度变弱的时候，不能只依赖模板，一定要把FMO对照、阴性对照还有生物学上的预期结果摆在一起综合判断，然后重新调整门控的位置。

　　三、模板复用之后的检查方法

　　等模板批量套用完，千万不要匆匆忙忙地就直接把统计结果导出去，至少得去抽查几个关键的门控，再看看那些看上去不太正常的样本，确保偏移没有干扰到最后的结论，不然做出再漂亮的统计表也靠不住。

　　1、对每个分组都去抽几管看看

　　每个实验组、每个处理组，还有每一批次的样本，都至少要打开其中几管，去检查一下主门和关键标记门到底画得合适不合适，不要只盯着第一管样本就觉得万事大吉了。因为排在后面或者采集时间比较晚的样本，可能会因为采集时长或者样本本身的质量问题，让细胞群发生往后漂移的情况，每个组都覆盖到才能看得全面。

　　2、把阳性边界当作重点来查

　　阳性和阴性细胞的分界线，不要只依赖上一批模板定下的位置，这样很容易产生误判，应该把FMO对照、未染色的对照以及补偿用的对照集中在一起观察，如果发现整体边界都发生了变化，那就优先去修正补偿和变换方面的设置，等这些基础问题解决了，再去判断门本身是不是只需要稍微微调一下就好。

　　3、留下模板和修改的记录

　　在正式展开分析以前，先把原始模板单独保存一份，批量套用结束后，再另外存下来一个分析用的工作区。对于中间手动调整过的样本，一定要把原因记清楚，比如是因为补偿异常、细胞群发生了漂移，还是样本质量太差才不得不改的，这样后面团队再复核的时候，就能明白当时为什么没有全部死板地沿用同一套模板。记录详细一点，回头解释起来会省掉很多口舌。

　　总结

　　总结来说，FlowJo门控模板的复用以及套用后出现偏移的处理，大致可以按照下面的顺序来操作：先挑选一个代表性样本去搭建标准的门控树，然后再把它复制到各个样本组，或者保存成模板Workspace；等到批量套用完成后，如果发现门控出现了偏移，就要先检查补偿矩阵、变换设置、坐标缩放情况和样本质量。模板虽然能大幅度提升工作效率，但它终究没办法取代对关键样本和阳性边界的人工复核，这一点在分析过程中尤其要放在心上。