流式分析做到最后一层门时，目标群体可能只剩下几十个事件。单看末级图，可以看到这些事件的荧光分布，却很难判断前面的散点门有没有把一部分候选事件挡在外面。FlowJo的反向门控可以把末级筛选放回上游门控的背景中查看。它适合用来检查门的位置，也能帮助解释目标群体为什么变少。读图时尤其要分清，哪些点通过了原有门控，哪些点来自暂时跳过某一道门的对照计算。

　　一、FlowJo怎么做反向门控

　　以FlowJo v10为例，反向门控从布局编辑器里的图形右键菜单进入。要回查的子群体至少经过两道连续的门，选中样本文件本身或只经过一道门的群体，无法按同样方式查看多层门控。

　　1、把末级群体放入布局

　　①在【Workspace】中展开样本的门控树，选中要回查的末级群体，例如活细胞下的标记阳性群体。

　　②打开【Layout Editor】，把末级群体的名称从【Workspace】拖到布局空白处。

　　③在生成的图上单击右键，选择【Backgating】，查看展开的多幅门控图。

　　④若希望从左到右对照各层，在反向门控图上单击右键，选择【Orient Horizontal】。

　　2、核对门控路径和图形显示

　　①回到【Workspace】，确认布局中的图来自预定样本和分支，逐层核对末级群体的上游门名称。

　　②在【Layout Editor】中选中反向门控图，打开【Object】选项卡，按需要调整填充色、线条颜色或线型。

　　③需要单独看上游各层时，在布局图的右键菜单切换至【Show Ancestry】，对照原有门控层级。

　　显示上游层级有助于弄清分析路径，反向门控还会显示某道门对末级结果的影响。两种视图看起来相近，如果布局里只有上游图，没有预期的叠加效果，可以回到右键菜单核对当前启用的显示方式。

　　二、FlowJo反向门控图怎么看

　　每幅小图都有自己的坐标轴和门控背景。看图时先弄清这一幅在检查哪道门，再判断叠加事件落在门内、门边还是门外。

　　1、识别各幅图对应的筛选条件

　　①在【Workspace】中沿目标群体向上核对门控路径，记下各层使用的参数。

　　②返回【Layout Editor】，对照各幅图的横纵轴和门边界，找到要检查的那道门。

　　③对照【Backgating】图中的事件显示及当前配色，区分完整门控下保留的事件，以及用于查看该层筛选影响的对照事件。

　　2、看门外的点是怎样出现的

　　假设门控顺序为散点范围、活细胞、标记阳性。检查活细胞门时，FlowJo可以在仍满足前面散点条件的事件中，查看跳过活细胞门后哪些事件符合后面的阳性条件。这时图上出现门外的候选点，并不表示它们已经计入原来的阳性群体。

　　①在【Backgating】图中找到活细胞门对应的面板，查看门外候选点是紧贴边界，还是与门内群体明显分开。

　　②回到【Workspace】打开对应的上游群体，核对该门使用的参数和边界。

　　③对照同批样本的活死染对照，检查门外候选事件是否也落在应排除的区域。

　　3、读百分比前确认分母

　　①在【Workspace】中选中原门控树里的末级群体，打开【Frequency Of】，按需要添加相对父群体或相对整个样本的频率。

　　②用【Add Statistic】添加【Count】，记录末级群体的事件数，并核对所用参照群体的计数。

　　③在汇报中标明百分比的分母，将原门控统计与反向门控中的对照事件分开记录。

　　比如末级有60个事件，直接父群体有600个事件，整个样本有6000个事件。同一批末级事件可以对应父群体的10%，也可以对应整个样本的1%。图上点的疏密适合观察分布，判断数量差异时还要看计数和明确分母的统计值。

　　三、FlowJo反向门控发现门边有事件怎么处理

　　门边出现一小簇事件，可以作为复查的线索。是否移动边界，要看这批事件在对照样本中的表现，也要看调整之后会放进多少原本应排除的事件。

　　1、把门边的现象放回原图检查

　　检查散点门时，可以留意门外事件是否延续了门内群体的分布；检查荧光门时，则应结合相应对照判断信号。单看叠加图里的几个点，容易把背景也算进去。

　　①在【Workspace】中打开有疑问的上游群体，切回原来画门所用的横纵轴。

　　②在【Layout Editor】中加入对应的对照样本图，使用相同参数和显示尺度，比较目标区域与背景区域。

　　③对少量门边事件，记录【Count】及其在同批其他样本中的表现，再判断是否值得调整门线。

　　2、比较改门前后的末级结果

　　①保存一份当前【Workspace】作为对照，在工作副本中只调整有疑问的一道门。

　　②重新查看末级群体的【Count】和【Frequency Of】结果，用相同的分母口径比较调整前后。

　　③回到【Layout Editor】查看【Backgating】图，核对新增事件来自哪一片区域，并检查对照样本是否也出现类似增加。

　　边界调整后，目标样本多出一些事件，对照样本也在同一位置同步增加，就要考虑是否放进了更多背景。把原门线和试调结果一并保留，后面更容易说明这次修改的依据。

　　总结

　　反向门控适合回答一个具体问题：某道上游门对末级结果产生了什么影响。图上看到候选事件落在门外，可以据此回查参数、边界和对照，但门外事件的身份仍要结合实验条件判断。整理分析结果时，把反向门控图和原门控的事件数放在一起，更容易说明为什么保留原门，或为什么调整了某一处边界。